今天要和大家分享的主題是由普林斯頓大學分子生物學系Tianero, M.D.等研究人員發表在Nature Microbiology的“Localized production of defence chemicals by intracellular symbionts of Haliclona sponges”文章。作者通過MMI CellCut PLus激光顯微切割技術、二代測序技術、流式分選技術及FISH技術等做了一個有趣的研究，在含有renieramycin生物堿的海綿Haliclona sp.中發現能產生renieramycin生物堿的共生菌Candidatus Endohaliclona renieramycinifaciens（Ca. E.?renieramycinifaciens）。值得注意的是，共生菌Ca. E.?renieramycinifaciens已經經歷了極端的基因組減少，它幾乎失去了自由生活所需的所有元素，同時保持了一個復雜的、質粒編碼的多拷貝renieramycin生物堿生物合成基因簇。共生菌Ca. E.?renieramycinifaciens存在于海綿以前未經鑒定的細胞庫（化學細菌細胞）中，它產生的renieramycin生物堿為宿主提供一種抵御捕食和微生物感染的化學防御手段。這種共生關系在Haliclona海綿的一個分支中具有高度的特異性。
 
海洋海綿是微生物多樣性最豐富的后生動物宿主之一。它們被認為是最原始的生物，是研究微生物與宿主相互作用的良好模型系統。海綿中的共生菌會產生許多具有不同生物活性的復雜代謝產物，其中包括未被充分研究的海綿代謝產物renieramycin生物堿。迄今為止，已經發現了約30種renieramycin生物堿，它們發揮了廣泛的抗微生物和細胞毒性活性，這些活性在生態和治療上都具有重要意義。從生物合成的角度來看，對renieramycin生物堿的了解還很少。renieramycin生物堿核心結構類似于四氫呋喃類的黃霉素，由于其組分較為廣泛，引發了作者的研究興趣，想確定最原始的后生動物：海洋海綿中的renieramycin生物堿生產的來源和分子基礎。

首先，作者收集了四種來自不同太平洋地區不同年份和地理位置的含renieramycin生物堿的Haliclona海綿樣品：Ren-Pal-02（帕勞，2002年），Ren-PNG-07060，RenPNG-07113（巴布亞新幾內亞，2007）和Ren-Bali-16-03（巴厘島，2016）。通過高效液相色譜結合高分辨率串聯質譜（HPLC-HR-MS / MS）和核磁共振（NMR）化學分析驗證了這些海綿中確實存在renieramycin生物堿。然后通過18S rRNA測序，確定了4種海綿具有較高的同源性（99.9％）。隨后通過對4種海綿進行宏基因組測序分析，發現在海綿微生物中存在renieramycin生物堿生物合成基因簇（BGC），并進一步通過驗證了ren（renieramycin生物堿生物合成基因簇，renieramycin BGCs）參與renieramycin的生物合成。

在發現了具有明顯細菌起源的ren之后，作者試圖進一步找出其基因組中含有ren的微生物組的成員，且該成員負責renieramycin生物堿的生產。通過對宏基因組的分析，發現ren存在于所有四個樣品基因組中的一個小的細菌質粒上：p-ren。通過對宏基因組的分析發現有一個細菌染色體在序列保守性水平、覆蓋率和GC含量上與p-ren相似，并把這種細菌命名為Ca. E.?renieramycinifaciens。通過流式分選海綿勻漿的細胞，將細胞分類為不同大小的細胞（P3-P10）,分別提取DNA進行16s rRNA測序，并對P4和P7到P10進行宏基因組測序。對測序結果進行分析發現Ca. E.?renieramycinifaciens和p-ren主要富集在比較大顆粒的細胞中，且在五個分區的基因組中，Ca. E.?renieramycinifaciens染色體和p-ren呈強正相關。進一步通過熒光原位雜交（FISH）和顯微鏡成像證明了Ca. E.?renieramycinifaciens是一種細胞內共生體，僅存在于大型海綿細菌細胞（sponge bacteriocyte）中。

盡管流式細胞術、細胞分類和宏基因組結合分析為p-ren與Ca. E.?renieramycinifaciens染色體的共域化提供了有力的支持，并且從顯微鏡下發現Ca. E.?renieramycinifaciens存在于特殊的海綿細菌細胞中，但還不足以說明Ca. E.?renieramycinifaciens中帶有p-ren。因此作者試圖進行最后一個實驗，確定p-ren到Ca. E.?renieramycinifaciens的位置。

借助易于識別的大海綿細菌細胞的球形形狀，使用MMI CellCut PLus激光捕獲顯微切割（LCM）從稀釋的Ren-Bali-16-03海綿勻漿中分離出100個此類單細胞。然后，從捕獲的細胞中提取并測序了DNA，并與從捕獲的背景膜中分離出的DNA作為對照進行了比較，分析了它們的宏基因組。結果明確表明Ca. E.?renieramycinifaciens帶有p-ren，并將renieramycin生物堿的產生進一步局限在海綿狀細菌細胞中。因此，作者提出術語“化學細菌細胞”來描述海綿細胞，在該海綿細胞中，細胞內細菌共生體會產生化學防御分子。

最后，作者還根據16S rRNA基因及宏基因組數據的分析，證明了Ca. E.?renieramycinifaciens基因組極度減少，為不能自由生活的專性長期共生體。利用高通量16S rRNA基因測序數據和18S rRNA基因序列構建的宿主海綿的系統樹比較了不同的海綿，證實了Ca. E.?renieramycinifaciens是一種特異性的海生海綿分支的細胞內共生體，在那里它控制著生物群落，專門生產renieramycin生物堿。

通過作者的研究，可以深刻了解到海綿將重要的結構和防御作用外包給了在其化學細菌細胞內共生的特殊化學細菌Ca. E.?renieramycinifaciens。這個例子發生在最古老的后生動物身上，代表了微生物與宿主相互作用的祖先觀點，并強調了在海綿體中發現更多細胞內共生體的重要性。

參考文獻
Tianero, M.D., Balaich, J.N. & Donia, M.S. Localized production of defence chemicals by intracellular symbionts of Haliclona sponges. Nat Microbiol 4, 1149–1159 (2019). https://doi.org/10.1038/s41564-019-0415-8

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